为什么篮斑做PCR菌液鉴定也能P出来条带呢

话题：为什么篮斑做PCR菌液鉴定也能P出来条带呢

问题详情：我用蓝白斑做的 T载体和目的片段连，为什么篮斑的 做PCR菌液鉴

回答：1 如果你用了目的片断特异的引物，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），这样验证阳性克隆时建议你 1〉用T-vector两端的测序引物（如M13F+R），做个PCR，看能否扩出目的大小的带，如果有，说明肯定有片断连入T载体；如果能用一个测序引物和一个你自己的引物扩增就更好了，不但可以确定 入的方向还可以肯定是你的片断 入。 2〉如果你没有这些引物，可以抽出质粒后，用你的特异引物，进行较少循环数的扩增，如果能拿到很亮的带，那么很可能是阳性；因为提质粒后蘸附的片断会很少，而质粒作模板有利于目的基因的克隆；当然你也可以酶切验证

话题：我做PCR阴性对照的水也能P出目的条带,请问都会是什

问题详情：结果水里也能P出来目的条带，检测了很多次，试剂换了好多种，

回答：水就是能扩增出来。原因不详，可能由于气溶胶，所用的试剂里有模板等。不用再耗时间排原因了，你排不出来的。我做过任何你能想出来的可能原因。

参考回答：引物可能 了，换一下引物

话题：请教各位大侠,是否可以在同一个PCR程序中P出不同退火

回答：现在的PCR仪都可以预先算好 度梯度的，输入平均 度和△T就可以算出各道的 度在退火这一步选择相同的梯度设置就可以P不同退火 度的反应了

话题：pcr条件设定：我要p 一个2000+bp的片段

问题详情：我的两个引物都是33bp GC含量为43% p过两次 都是引物二聚体

回答：原因分析： 二聚体问题，基本可以确定为引物设计不当你的引物很长，一般2kb的片段，有22bp的引物就足够了，你这么才长的引物，非常容易形成发夹结构，或者其他互补情况，最后形成二聚体。另外，你的引物CG含量有点低，弄到55%会稳定很多。解决方法： 首先，你应该尝试低 退火+热启动的PCR方法，具体为：首次循环加热到5度后，暂停PCR，开盖，逐个加入PCR酶，然后降低退火 度，可以做一个梯度，每次降低一度试试。如果上述方法不行，你应该重新设计引物，保证16-1个配对碱基的前提下，用软件模拟避免发卡结构和引物互补，保证GC含量在55%左右。再P不出来，你就查你的目的基因序列去，肯定弄错序

参考回答：标准的PCR反应体系： 10*扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5

话题：求助：胶回收：雀式pcr第一对pcr引物扩增后

问题详情：怎么知道目的片段 p?

回答：一般是不要切胶，直接把第一次的PCR产物取一微升作为底物，再用第二队引物扩增一次，如果引物设计正确，就只会出现一条条带了。如果要计算大小，就按楼上说的。但是雀式pcr的目的就是至少做2次，以保证特异性。

参考回答：下游引物的位置号减去上游引物的位置号就是大概的片段长度，例如引物是33F-51R，产物为200bp左右。

话题：一个PCR的primer设计问题

问题详情：第一个外显子至少需要结合多少个碱基才能保证我P出的两个外显

回答：我在想你是不是说的重叠pcr。如果是的话十几个二十个都可以的。一篇文章上说过有用个的。