pcr设计的引物所加的酶切位点和保护碱基要什么-小知识

话题：pcr设计的引物所加的酶切位点和保护碱基要什么顺序(上游

回答：没什么特别的,在酶切位点前或后加2-3bp碱基就可以,只是注意保持引物设计的原则,以及不能产生新的酶切位点

话题：引物 加酶切位点以后还要分析吗?

回答：看样子你是要做克隆,给你说说我的经验吧, 带酶切位点的引物设计:保护碱基(4个)+酶切位点(6或个)+与模板匹配序列(15-20个)。如果是一般的质粒做模板15个配对的绝对没问题,如果是比较复杂的模板,文库一类的,20-25个。 保证3‘端的5个碱基里有3个是G/C就行。我从来不用软件分析的。 PCR时,退火 度就是60度,25个循环。 你试试吧,肯定没问题的,我以前设计引物时也是很小心的,用软件分析半天,其实发现没有多大影响的。发卡结构,3’封闭,GC含量,TM值,影响也都不是这么大。 纯属经验,希望你的实验有好结果吧

话题：通过设计带酶切位点的PCR引物来使目的片段添加 性酶

问题详情：怎么能随着引物克隆到目的片段 而使目的片段带上酶切位点的序

回答：不是随意添加。酶切位点都加在引物的5‘端。这样在第一轮扩增后,就会产生有酶切位点的产物了(酶切位点在产物的两端)。在接下来的扩增中每个产物就都会有了。PCR的时候可以耐受引物的5‘端由数个不匹配的碱基对。但是随着扩增的进行,产物都有这些位点后,就不存在不匹配的问题了

话题：如何向引物中加酶切位点

回答：设计引物的时候在5’端把酶切序列加进去,酶切位点5’端旁边要有几个保护碱基(具体数量跟酶切位点有关,需要查说明书)

话题：我在设计引物,加酶切位点时,可否把它切掉?

回答：EK位点是肠激酶的切割位点,蛋白表达纯化完后可以用肠激酶将N端的 切掉(像His tag, S tag).如果你觉得没必要切去 的话,设计引物时完全可以将这个位点去掉。

话题：克隆设计引物 入酶切位点的问题

问题详情：设计引物时是不是讲酶切位点 入到5’端就可以了?加的保护基

回答：你要选择合适的内切酶,首先要考虑你真菌的全基因 度呢。还有要多参考类似真菌的全基因组克隆文章。

话题：再设计引物时,添加酶切位点和 后,正反两个引物相差

回答： 是指的表达 么?如果是表达 的话,载体上没有么?通常表达 不是通过引物引入的,而是载体本来带有的,这个需要确认一下。 另外,引物的使用主要是看Tm值的差异,如果设计后,两条引物的Tm值相差过大,是不能够使用的,因为在退火时,找不到合适的退火 度。因此不能简单通过长短进行判断,需要根据两条的Tm值比较。一般引物设计软件上都有,如果相差太大,没法用。 另外,引物的长度也是有一定的 的,20-35的长度比较理想,过长和过短都会个扩增带来麻烦, 相差就差了20个,感觉有条引物太长了。确认下, 是不是一定要带在上面。

话题：PCR时引物的5‘端有时需要加酶切位点请问是怎么加上去的

问题详情：越详细越好啊谢谢啊!!!!!

回答：DNA合成,新链的延伸方向是5→3 因此,需要在5端加上酶切位点 酶切位点可以上网查 同时,记得再加上一些保护碱基 因为内切酶除了有特异的识别位点之外,还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去,否则会掉下来 保护碱基的具体数目可以上NEB的 查 那么,引物的结构就是(5→3):保护碱基+酶切位点+原来的引物序列

话题：其中涉及的引物为什么要加酶切位点?难道不论载体都要加

回答： 目的基因后一般需要将目的基因连接到质粒载体上,在引物上加酶切位点可以使后续的连接过程简单、可控。因为可在载体和目的基因上酶切产生相同的切口。也有不需要加酶切位点的T载体,但连接过程效率不高还会有反向的错误连接。

话题：我想在PCR产物上加一个酶切位点,请问正向引物和反向引物

回答：酶切位点多数时候是反向回文结构,因此你看到的正向序列与反向互补序列是相同的,所以在两个方向的引物上看,酶切位点序列完全一样。