影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些

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温度、PH 和浓度

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问题1：过氧化氢酶的测定[生物科目]

　　使用过氧化氢酶检测试剂盒是比较简便的方法：

　　过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶

　　(Catalase)活性的试剂盒.在过氧化氢相对比较充足的情况下,过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气.残余的过氧化

　　氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物,产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-

　　benzoquinonemonoimine),最大吸收波长为520nm.用过氧化氢标准品,制作标准曲线,这样就可以计算出样品中的过氧化氢

　　酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气,从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力.

　　Ø 过氧化氢酶分布非常广泛.在肝脏、肾脏和红细胞中,过氧化氢酶的水平非常高,这些器官和细胞是清除能导致氧化损伤的过氧

　　化氢的主要场所.

　　Ø 过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A240,但蛋白质或其它组份在A240附近都有比较强的吸收,会对测定产生严重干

　　扰.因此,用紫外法测定过氧化氢酶的活性,比较适合纯化的过氧化氢酶.本试剂盒通过检测A520来测定过氧化物酶催化下由过

　　氧化氢氧化生色底物产生的红色产物,受干扰的因素小,检测灵敏度高,可以检测出低达1U/ml的过氧化氢酶.

　　Ø 本试剂盒可以检测全血、红细胞裂解产物、血清、组织匀浆产物、细胞裂解产物等生物样品中的过氧化氢酶的活性.一个试剂盒

　　共可以进行100次检测.

　　使用方法：

　　配制250mM过氧化氢溶液.本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M.由于过氧化氢不是非常稳定,使用前需自行测定过氧化氢的

　　实际浓度.把浓度约为1M的过氧化氢用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液稀释100倍,使过氧化氢的浓度约为10mM.测定

　　A240.

　　过氧化氢(mM)=22.94XA240

　　从而计算出本试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度.然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液.

　　b.配制5mM过氧化氢溶液.根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液.

　　c.配制显色工作液.在冰浴上溶解显色底物,适当分装后再使用,尽量避免反复冻融.其它试剂放置在冰浴上备用.取适当量的过

　　氧化物酶,按照1:1000的比例用显色底物稀释,配制成显色工作液.例如取5微升过氧化氢酶,加入5ml显色底物,混匀即得到

　　5ml显色工作液.

　　2.样品的准备：

　　用适当的裂解液裂解细胞或组织(可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液进行裂解).用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测

　　缓冲液稀释样品,裂解好的样品至少加入等体积的过氧化氢酶检测缓冲液进行稀释.具体的稀释倍数可以参考表1.

问题2：过氧化氢酶活性测定公式计算方法请问过氧化氢酶测定公式中As1和As2到底代哪个数值啊?测定方法中说是一分钟测一次,共测4次,那么4个值咋代入公式中呢?[生物科目]

这样应该可以了吧

一、实验目的：

（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤.

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数.

（3）掌握离心机的使用.

二、实验原理:

邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,中间物的积累在滞留30～45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长处有强烈光吸收.当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性.

三、实验试剂：

大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8,0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根

四、实验步骤：

（1）SOD提取：

称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞,加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液,研磨搅拌20分钟,使SOD充分溶解,6000rpm离心,弃去沉淀,得上清液.(留出1mL备用,准确量取剩余上清液体积,记录)

（2）除杂蛋白：

提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min,6000rpm离心15min去沉淀,得粗酶液.（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）

（3）SOD酶的沉淀分离：

剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000rpm离心15min,得到SOD酶沉淀.将沉淀先加2mL磷酸缓冲液,溶解后再加3mL混匀.6000rpm离心15min,取上清得到SOD酶液.取1mL备用,其余量取体积.

（4）粗酶液活性测定：

提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测,具体步骤如下.

加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.

试剂/（mL）

空白管

对照管OD1

提取液OD2

粗酶液OD2

酶液OD2

PH8.3缓冲液

3

3

3

3

3

SOD提取液

0

0

0.1

0.1

0.1

蒸馏水

2

1.8

1.7

1.7

1.7

室温放置20min

邻苯三酚

0

0.2

0.2

0.2

0.2

（5）溶液中可溶性蛋白含量测定：

分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.

提取液稀释：50 ×

粗酶液稀释：20 ×

酶液稀释：10 ×

五、实验数据：

提取液

粗酶液

酶液

总体积（ml）

提取液

粗酶液

酶液

260nm吸光度值

280nm吸光度值

公式

蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280－ 0.74A260) ×稀释倍数

蛋白质浓度（mg/ml）

对照管（OD1）

提取液（OD2）

粗酶液（OD2）

酶液（OD2）

420nm吸光值

六、实验结果及数据处理：

（1）酶活力单位

提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=

（2）总活力

提取液总活力U=活力单位×总体积=

粗酶液总活力=活力单位×总体积=

酶液总活力=活力单位×总体积=

（3）比活力

提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=

（4）纯化倍数

粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=

酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=

（5）回收率

粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=

酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=

七、实验结果误差分析：

（1）研磨和离心大概还不够充分.

（2）由于测量仪器的精密度引起的误差.

（3）在操作的过程中,加入邻苯三酚后未混合均匀,可能致使化学反应进行得不很充分,这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；

（4）在实验过程中,所需化学试剂加入的量不是很准确,这可能是实验数据出现问题的另一个原因；

（5）此外,实验本身还很粗糙,酶的提取、分离和纯化都不能十分彻底,还有很多杂蛋白干扰实验.

问题3：过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,再用0.1mol/L 草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L,取30%H2O[化学科目]

“取KMnO4（AR）3.1605g,用新煮草酸溶液沸冷却蒸馏水配制成1000ml”在这一步后,把0.1mol/L 草酸溶液吸取5毫升至于锥型瓶中,稀释,然后用新配的高锰酸钾滴定,至分红色为终点.

双氧水和这一样,就是把草酸换成双氧水就行了

问题4：怎样测定温度影响过氧化氢酶的活性?温度升高,过氧化氢自身分解加快了,该怎么测定呢跟我问的不是一回事[政治科目]

加入对照组,其他条件一样,就是温度设定值不一样.比方说：分几组——0摄氏度,37摄氏度,100摄氏度.但是温度过高或者过低都会影响酶的活性.回答完毕

问题5：过氧化氢酶的活力和动力学常数测定,加入硫酸的作用[生物科目]

硫酸用于过氧化氢酶的灭活.

酶制剂在强酸、强碱及高温条件下会失去活性.