二代测序数据中的PCR duplication是什么，是怎么产生...

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是引物的3'端间相互错配扩增形成的.引物二聚体的出现是必然的,只是或多或少的问题,电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现,只是含量低我们的肉眼看不到而已.提高PCR严谨性(包括提高退火温度,降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度.

减少PCR产物中引物二聚体的方法:

1从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;

2.可能模板有问题;模板浓度过小,适当加大模板量;

3.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;

4.取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体.不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体.

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;

6.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体.

7.增加循环数;

8.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);

9.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别,则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对.

10.以上次的PCR产物作模板二次PCR,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100－1000倍,如果间隔较长可以稀释50－100倍.

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问题1：PCR产物测序结果分析我的引物产物长度为352bp,PCR产物电泳后一直是420左右,所以送了PCR产物去测序,结果出来了,但是我自己不会分析.请问怎么能分析透彻,得到最大量的信息,发现有意义的东西?[生物科目]

首先你要有你目的产物和测序的DNA序列

在网页最下端第二行有Align two sequences using BLAST (bl2seq) ,点击进入

看到有Sequence 1和Sequence 2,这里面分别输入你的PCR产物的序列和你测序的序列,最后点击Align,就会出现两个序列的对比结果.

关于怎样分析,怎样得到最大量的信息,怎样发现有意义的东西,这就是和你的课题有关系了.

比如说某人做的是突变,就需要分析哪些位点突变了,这些位点突变了影不影响氨基酸的变异,若是氨基酸变异了,对蛋白质的表达有什么影响和作用.等等

问题2：为什么基因测序前将基因PCR克隆后还要放到大肠杆菌载体上再测序?除了防止PCR产物降解外还有别的原因吗?[语文科目]

一楼完全没说到重点,二楼正解.

你看过测序的结果就知道了,前面的几十个碱基是无法识别的杂峰,最后几百个碱基也是无法识别的杂峰,尽管结果中还是以单个碱基字母的形式给你写出来,但是那是0智商的机器自动记录的,你要人工剔除这部分序列,也就是说你不知道这部分序列的真实数据.

放到载体上就是为了把前面这几十个测序弄不出来的碱基放到质粒的部分,不清楚就不清楚,我们反正不需要知道,我们需要知道的序列完全落在后面清楚的部分就行了.

问题3：PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?[生物科目]

众所周知,PCR圹增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置.PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果.如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数 分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的,在测序时,错配现象也就是反映不出来了.因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果.而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列.在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配.因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同.这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能.要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶.--------转自三博远志网站(测序FAQ)

问题4：直接PCR测序法与Sanger法测序是一样的吗[政治科目]

不是一个范畴的内容.

直接PCR测序法一般是指我们直接采用测序的方式来鉴定的方法,与其对等的一般是比如说是在基因型鉴定的RFLP,STR啊等等.

而Sanger测序只是测序技术中的一种方法,于此对等的是像NGS啊,N-NGS啊等测序方法.

两者间的差异在于,前者是班级这个层面上的,而后者是班级里的一个人这个层面上的.

问题5：为什么测序前要PCR?PCR是体外扩增DNA的,是不是适用于那种不能培养的菌?直接从杂菌中把里面的各种菌纯化培养,拿去测序不可以吗?为什么一定要PCR呢?我是外行,[生物科目]

pcr是扩增dna的,在一般提取的DNA含量很少,测序不方便或者不能测序,所以用PCR扩增一下,量大点,容易测得结果.